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2021-10-22
固体和半固体样品:
称取25g样品,置于225 mL生理盐水的无菌均质袋中,用拍击式均质器拍打lmin~2min制成1:10的样品匀液;或置于盛有225mL灭菌生理盐水的无菌均质杯中,8000r/min~10000r/min均质lmin~2min制成1:10的样品匀液。
液体样品:
应先将其充分摇匀后,以无菌吸管吸取样品25mL放入装有225mL生理盐水的无菌锥形瓶(瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠)中,充分振摇﹐制成1:10的样品匀液。
样品稀释:
用1mL无菌吸管或微量移液器吸取l:10样品匀液lmL,沿管壁缓慢注于装有9 mL生理盐水的无菌试管中(注意吸管尖端不要触及稀释液),振摇试管或换用1支无菌吸管反复吹打使其混合均匀,制成l:100的样品匀液。
另取1mL无菌吸管或微量移液器吸头,按上述操作顺序,做10倍递增样品匀液,每递增稀释一次,即换用1次lml灭菌吸管或吸头。
培养:
根据对待检样品菌含量的估计,选择2个~3个连续的适宜稀释度﹐每个稀释度吸取样品匀液0.1mL接种于KF链球菌琼脂平板内,使用涂布棒尽可能小心快速地涂布接种液于琼脂表面,涂布棒不得接触平皿边缘。每个稀释度接种2个平板。涂布后,将平板静置10 min使接种物完全被培养基吸收。翻转平皿置于37℃±1℃厌氧培养箱中培养48h±2h。
菌落计数:
选取特征菌落数在30CFU~300CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于30 CFU的平板记录具体菌落数,大于300 CFU的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。
其中一个平板有较大片状菌落生长时,则不宜采用,而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数;若片状菌落不到平板的一半,而其余一半中菌落分布又很均匀,即可计算半个平板后乘以2,代表一个平板菌落数。
当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时,则将每条单链作为一个菌落计数。
鉴定:
菌落挑选和纯培养
挑选平板上5个暗红色至粉红色,表面光滑,周边整齐的菌落分别转入肠球菌肉汤培养基37℃±1℃恒温培养箱中培养24h±2h后进行形态学、生化鉴定。
形态学鉴定:
革兰氏染色,镜检。粪肠球菌为革兰氏阳性球菌,呈球形或椭圆形,直径0.5u.m~1.0um,成对或短链状排列,无芽孢。
生化鉴定:
使用细菌生化鉴定yabo官网手机版 盒进行生化鉴定。
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