细胞色素C提取过程
2019-03-28
本品为生物氧化过程中的电子传递体。其作用原理为在酶存在的情况下,对组织的氧化、还原有迅速的促酶作用。通常外源性细胞色素C不能进入健康细胞,但在缺氧时,细胞膜的通透性增加,细胞色素C便有可能进入细胞及线粒体内,增强细胞氧化,能提高氧的利用。
三羧酸循环中产生的琥珀酸辅酶A,其肽链仅有104个氨基酸,体内大量存在,无需外源补充;且外源补充与体内含量相比甚微。细胞色素C是生物氧化的一个非常重要的电子传递体,在线粒体嵴上与其它氧化酶排列成呼吸链,参与细胞呼吸过程。
合成方法
1.将新鲜或冷冻猪心,洗净,去血块、脂肪和肌腱等,切条,用绞肉机绞碎。然后加入1.5倍的水,用1mol/L的硫酸调节pH值为4左右,常温下搅拌,浸提2h,压滤。滤液用1mol/L的氨水中和至pH=6.2,离心分离取清液。
2.残渣再用等量水重复提取一次,合并两次提取液。提取液用2mol/L氨水调pH值为7.5,静止沉淀杂蛋白,离心,吸取上层清液。然后按每升提取液加入10g沸石,在不断搅拌下充分吸附40min,静置,弃去上层清液。用蒸馏水洗涤吸附有细胞色素C的沸石3次,用0.2%的氯化钠洗涤4次,再用蒸馏水洗至洗涤液澄清。
3.过滤沸石,抽干,装入色谱柱中,并用25%的硫酸铵溶液洗脱,收集洗脱液。洗脱液中加入固体硫酸铵使浓度达45%,杂蛋白完全析出,过滤。滤液中缓慢加入三氯乙酸(20%)溶液,边加边搅拌,待细胞色素C沉淀完全析出后,离心收集沉淀。将沉淀溶于蒸馏水,用水透析至无硫酸根离子。
4.将透析后溶液通过已处理好的Amberlite IRC50(NH+4)树脂柱吸附,用水洗涤至澄清,再用磷酸氢二钠(0.6mol/L)和氯化钠(0.4mol/L)混合液洗脱,洗脱速要慢,一般流速为2ml/min。洗脱液再用蒸馏水透析至无氯离子为止,可得细胞色素C精品溶液。收率为100~150mg/kg,含量大于20mg/ml。
三羧酸循环中产生的琥珀酸辅酶A,其肽链仅有104个氨基酸,体内大量存在,无需外源补充;且外源补充与体内含量相比甚微。细胞色素C是生物氧化的一个非常重要的电子传递体,在线粒体嵴上与其它氧化酶排列成呼吸链,参与细胞呼吸过程。
合成方法
1.将新鲜或冷冻猪心,洗净,去血块、脂肪和肌腱等,切条,用绞肉机绞碎。然后加入1.5倍的水,用1mol/L的硫酸调节pH值为4左右,常温下搅拌,浸提2h,压滤。滤液用1mol/L的氨水中和至pH=6.2,离心分离取清液。
2.残渣再用等量水重复提取一次,合并两次提取液。提取液用2mol/L氨水调pH值为7.5,静止沉淀杂蛋白,离心,吸取上层清液。然后按每升提取液加入10g沸石,在不断搅拌下充分吸附40min,静置,弃去上层清液。用蒸馏水洗涤吸附有细胞色素C的沸石3次,用0.2%的氯化钠洗涤4次,再用蒸馏水洗至洗涤液澄清。
3.过滤沸石,抽干,装入色谱柱中,并用25%的硫酸铵溶液洗脱,收集洗脱液。洗脱液中加入固体硫酸铵使浓度达45%,杂蛋白完全析出,过滤。滤液中缓慢加入三氯乙酸(20%)溶液,边加边搅拌,待细胞色素C沉淀完全析出后,离心收集沉淀。将沉淀溶于蒸馏水,用水透析至无硫酸根离子。
4.将透析后溶液通过已处理好的Amberlite IRC50(NH+4)树脂柱吸附,用水洗涤至澄清,再用磷酸氢二钠(0.6mol/L)和氯化钠(0.4mol/L)混合液洗脱,洗脱速要慢,一般流速为2ml/min。洗脱液再用蒸馏水透析至无氯离子为止,可得细胞色素C精品溶液。收率为100~150mg/kg,含量大于20mg/ml。